Оглавление темы "Вирусология. Репродукция вирусов. Генетика вирусов.":
1. Вирусология. История вирусологии. Шамберлан. Ру. Пастер. Ивановский.
2. Репродукция вирусов. Репродукция +РНК-вирусов. Пикорнавирусы. Репродукция пикорнавирусов.
3. Тогавирусы. Репродукция тогавирусов. Ретровирусы. Репродукция ретровирусов.
4. Репродукция -РНК-вирусов. Репродукция вирусов с двухнитевыми РНК.
5. Репродукция ДНК-вирусов. Репликативный цикл ДНК-содержащих вирусов. Репродукция паповавирусов. Репродукция аденовирусов.
6. Репродукция герпесвирусов. Репликативный цикл герпесвирусов. Поксвирусы. Репродукция поксвирусов.
7. Репродукция вируса гепатита В. Репликативный цикл вируса гепатита В.
8. Генетика вирусов. Характеристика вирусных популяций. Генофонд вирусных популяций.

10. Генетические взаимодействия между вирусами. Рекомбинации и перераспределение генов вирусами. Обмен фрагментами генома вирусами. Антигенный шифт.

Нуклеиновые кислоты вирусов подвержены мутациям, то есть внезапным наследуемым изменениям. Сущность этих процессов заключается в нарушениях генетического кода в виде изменений нуклеотидных последовательностей, их выпадений (делеций), вставок либо перестановок нуклеотидов или пар в одно- и двухнитевых молекулах нуклеиновых кислот. Указанные нарушения могут ограничиваться отдельными нуклеотидами или же распространяться на более значительные участки. У вирусов выделяют спонтанные и индуцированные мутации. Их биологическое значение может быть связано с приобретением или потерей патогенных свойств, а также с приобретением свойств, лишающих их чувствительности к действию защитных механизмов организма-хозяина. Мутации, полностью нарушающие синтез или функцию жизненно важных белков, приводят к утрате способности к репродукции и иначе известны как летальные мутации. В их основе лежат изменения, приводящие к возникновению бессмысленных кодонов (с нарушением синтеза белковой цепочки) либо к появлению вставок или делеций (с глубокими нарушениями генетического кода). Мутации с потерей способности синтезировать определённый белок или с нарушением его функций, что в определённых условиях может привести к утрате способности к репродукции называют условно-летальными.

Спонтанные мутации вирусов

Спонтанные мутации возникают под действием различных естественных мутагенов и встречаются с частотой l:10-8 вирусных частиц. Чаще их можно наблюдать у ретровирусов, что связано с более высокой частотой сбоев в обратной транскрипции.

Индуцированные мутации вирусов

Индуцированные мутации вызывают различные химические агенты и УФ-облучение (у ДНК содержащих вирусов). Принципиальной разницы в перестройке генома, вызванной спонтанны ми или индуцированными мутациями, нет. Принято считать, что применяемые мутагены лиш увеличивают частоту спонтанных мутаций. При классификации вирусных мутаций используют два разных подхода: их разделяют по характеру изменений генотипа или по изменениям фено типа, наступающим в результате мутаций. Изучение изменений генотипа вирусов проводят редко, так как для этого необходимо детальное изучение их геномов. Чаще проводят изучен» фенотипических проявлений мутаций как более доступных для исследований.

Проявление мутаций вирусов в фенотипе

По фенотипическим проявлениям мутации вируса можно разделить на четыре группы.

Мутации , не имеющие фенотического проявления, не изменяют свойств вирусов и их выявляют лишь при специальном анализе.

Мутации , имеющие фенотипическое проявление (например, изменение размеров бляшек, образуемых вирусами в культуре клеток или термостабильность вирусов). Мутации, повышающие или снижающие патогенность, можно разделить на точковые (локализующиеся в индивидуальных генах) и генные (затрагивающие более обширные участки генома).

Наследственность - это свойство организмов обеспечивать материальную и функциональную преемственность между поколениями, а также обусловливать специфический характер индивидуального развития.

Изменчивость - свойство, противоположное наследственности. Изменчивость вирусов обусловлена мутацией генов, сочетанием их при рекомбинации и различным проявлением признаков, зависящим от внешних условий (модификационная изменчивость).

Генетические признаки (маркеры) вирусов . Все признаки вирусов, информация о которых закодирована в генах, называются генетическими. При этом многие признаки обычно обусловливаются несколькими генами.

Генетические признаки (маркеры) у штаммов определяют после предварительного их клонирования. Все их условно разделяют на основные группы:

• групповые и видовые: тип и морфология нуклеиновой кислоты; тип капсида и количество капсомеров; антигенная специфичность; устойчивость к органическим растворителям и детергентам; наличие фермента нейраминидазы и антигенов хозяина; гемагглютинирующие свойства; патогенность для определенного вида живых чувствительных систем;
• внутриштаммовые: гемагглютинирующая активность; терморезистентность; отношение к УФ-лучам, ингибиторам; характер бляшек и др.

Для проведения генетических исследований наибольшее значение имеют внутривидовые признаки, позволяющие дифференцировать варианты (мутанты, рекомбинанты) между собой.

В большинстве исследований генетические признаки обозначаются начальными буквами латинского алфавита с добавлением знака «+» или «-», т. е. наличие или отсутствие того или иного свойства. Отдельные признаки, например нейровирулентность (N), обозначаются двумя буквами в зависимости от вида животного, на котором проявляется это свойство: нейровирулентность для обезьяны - monN, нейровирулентность для мышей - mN и т. п.

Пока еще трудно унифицировать номенклатуру генетических признаков, поэтому для каждой группы вирусов оправдана специфическая символика их. Однако ряд признаков уже может иметь общие обозначения для всех видов вирусов.

Виды мутации вирусов . Вирусы изменяют свои свойства как в естественных условиях при репродукции, так и в эксперименте. В основе наследственных изменений свойств вирусов лежат два процесса:

• мутация - изменение последовательности нуклеотидов в определенном участке генома вируса, ведущее к изменению фенотипических свойства;
• рекомбинация - обмен генетическим материалом между двумя близкими, но отличающимися по наследственным свойствам вирусами.

Классификация мутаций .

По механизму :

1. деления - выпадение одного или нескольких нуклеотидов;
2. встраивание одного или нескольких нуклеотидов;
3. замена одного нуклеотида другим.

По длине измененной последовательности нуклеотидов :

1) точечная замена одного нуклеотида (PHK-содержащие вирусы) или одной пары комплементарных нуклеотидов (ДНК-содержащие вирусы). Такие мутации могут иногда восстанавливаться (ревертировать) до исходной структуры генома. Не всегда точечные мутации приводят к изменению фенотипа. Одна из основных причин, в силу которых такие мутации могут не проявляться, - это вырожденность генетического кода, т. е. кодирование одной аминокислоты несколькими триплетами. Поэтому структура белка и его биологические свойства не нарушатся. Если аминокислота кодируется только одним триплетом, то в этом случае в белок включается какая-нибудь иная аминокислота, что может привести к появлению мутантного признака;

2) аберрация - замена значительного участка генома. Аберрации у вирусов обусловлены делециями различного числа нуклеотидов: от одной пары до последовательности, которая детерминирует одну или несколько функций вируса.

По обратимости :

1) необратимые (прямые) мутации, при которых изменяется фенотип. Частота таких мутаций у вирусов колеблется в широких пределах. Это зависит от клеточной системы, в которой происходит развитие вирусной популяции. Одновременно клеточная система может являться и фактором селекции. Мутанты, возникающие в популяции, не остаются генетически чистыми линиями, а иногда могут быстро размножаться и практически полностью вытеснить остальные составляющие популяции;

2) обратимые мутации:

истинные реверсии, при которых обратная мутация происходит в месте первичного повреждения; псевдореверсии, при которых мутация происходит в другом участке дефектного гена (интрагенная супрессия мутации) или в другом гене (экстрагенная супрессия мутации). Реверсии не являются редкими событиями, так как измененные организмы обычно более приспособлены к данной клеточной системе.

По природе :

1) спонтанные мутации, которые в живой природе возникают чрезвычайно редко и под влиянием причин, трудно устанавливаемых в каждом отдельном случае. Такие изменения в популяции вирусов возникают без внешнего воздействия. Однородных популяций не бывает, поэтому в вирусной популяции в процессе ее развития спонтанные мутанты возникают с определенной вероятностью. Частота мутаций одного и того же признака может быть различной в зависимости от штамма.

Возникать спонтанные мутации могут в результате (по Уотсону и Крику, 1953):

а) таутомерного превращения (перегруппировок) оснований, входящих в состав нуклеиновой кислоты. Например, таутомерный сдвиг в положении атома водорода у аденина приводит к тому, что аденин при репликации спаривается не с тимином, а с гуанином. При спаривании оснований ошибка приводит в последующих репликациях к замене пары АТ и ГЦ.

Спонтанные мутации, возникшие в одном и том же гене, распределяются по его длине неравномерно. Одни участки гена изменяются часто («горячие» точки), другие - редко. Поэтому вероятность ошибок при спаривании оснований в различных участках гена различна. Это может быть связано с определенной конформацией нуклеиновой кислоты: отдельные нуклеотиды могут с большей степенью вероятности подвергаться таутомерному превращению, чем другие;

б) ошибок в работе ферментов: ДНК- или РНК-полимераз.

Примеры спонтанных мутаций .

1. Природная изменчивость антигенной структуры (гемагглютинина и нейраминидазы) вирусов гриппа человека и животных (в том числе птиц), на примере штаммов типа А2. Исходные штаммы типа А2 не различались между собой по антигенной структуре, тем, агглютинирующей активности, термостабильности, способности репродукции при 40°С и переходу и индикаторное состояние. (Индикаторный вирус - вирус, позволяющий выявить в культуре клеток другой нецитопатогенный вирус.) Позже штаммы, относящиеся к антигенным подгруппам А2/1, А2/2 и А2/3 (выделенные с 1968 по 1970 г.), показали изменение антигенной структуры и других биологических свойств этого возбудителя. Вначале исчезли ингибиторорезистентные штаммы, а затем ингибиторорезистентные варианты из смешанной популяции чувствительных к ингибиторам штаммов.

2. Гемагтлютинин и нейраминидаза вируса гриппа претерпевают изменения, независимые друг от друга. Например, вирус гриппа птиц, выделенный от индеек в штате Висконсин (США), содержал нейраминидазу, антигенно родственную нейраминидазе вирусов гриппа человека А2/Гонконг/68 и не схожий гемагглютинин, тогда как вирус гриппа, выделенный от свиньи на о. Тайвань, содержал антигены гемагглютинина и нейраминидазы, родственные антигенам вируса гриппа человека А2/Гонконг/68.

3. Известно 11 серовариантов вируса ящура (сем. пикорнавирусы) у типа О, 32 сероварианта у типа А, 5 - у типа С, 7 - у типа Sat-1 и по 3 - у типов Sat-2 и Sat-3. Штаммы вируса ящура типа Азия 1 также неоднородны по антигенной структуре.

4. Повышение или ослабление вирулентности возбудителя Изменения могут происходить в короткие сроки, поскольку жизненный цикл вирусов несравненно короче жизненного цикла хозяев. Известно наличие большого числа патогенных вариантов штаммов вируса болезни Ньюкасла (парамиксовирусы). При первом появлении болезнь в Европе протекала остро, с высоким процентом гибели птиц. В настоящее время все чаще регистрируются очаги с низкой летальностью и легким течением болезни. Происходит не только снижение количества очагов, но и аттенуация эпизоотических штаммов, что позволило выделить природно-ослабленные вакцинные штаммы B1, La Sota, F Бор/74/ВГНКИ.

5. Имеются сообщения о выделении природно-ослабленных штаммов вирусов чумы свиней (штамм Мияги), болезни Ауески (штамм Русс), миксомы кроликов и клещевого энцефалита:

2) индуцированные мутации, которые возникают при действии на вирус (вирион или вегетативную форму) различными химическими и физическими мутагенами, а также при адаптации вируса к необычным биологическим системам (адаптационная изменчивость).

После определения наследственных единиц вируса возникла перспектива получения живых вакцинных штаммов непосредственным воздействием на них физическими или химическими мутагенами, вызывающими структурные и функциональные изменения в молекуле вирусной кислоты. Применение искусственных мутагенов имеет два преимущества:

• они вызывают мутации в десятки и сотни раз эффективнее природных факторов;
• действие искусственных мутагенов имеет известную направленность; можно заранее предвидеть, на какие элементы структуры нуклеиновых кислот и каким образом действует тот или иной мутаген и какие изменения в них вызовет.

Химические мутагены . По классификации Фриза (1960) химические мутагены разделяют на две основные группы:

1. мутагены, реагирующие с нуклеиновой кислотой только во время ее репликации (аналоги пуриновых и пиримидиновых оснований);
2. мутагены, реагирующие с покоящейся молекулой нуклеиновой кислоты. Однако для формирования мутаций необходимы последующие репликации молекулы (азотистая кислота, гидроксиламин, алкилирующие соединения).

Молекулярные механизмы мутагенного действия химических соединений подразделяются на две основные группы (по Е. Фризу):

1) замена основания, которая бывает двух типов: а) простая (транзиция), когда на место одного пуринового основания встает другое (например, вместо аденина - гуанин) или одно пиримидиновое основание заменяется другим (цитозин - урацилом). Такие замены происходят при индукции мутаций азотистой кислотой, рядом алкилирующих соединений и гидроксиламином;

б) сложная (трансверсия), при которой вместо одного пуринового основания появляется пиримидиновое или пиримидиновое основание заменяется пуриновым. Трансверсии происходят при индукции мутаций этилэтансульфонатом;

2) выпадение (делеция) или вставка основания, которое ведет к более глубоким изменениям генетического кода, чем простая замена оснований. Мутационные повреждения в одном участке генома нередко приводят к изменению нескольких генетических признаков, имеющих различное фенотипическое проявление (плейотропия). В то же время основой изменения генетического признака, имеющего одно и то же фенотипическое выражение (например, способность размножаться при повышенной температуре), могут быть мутационные повреждения различных генов.

Мутагенное действие аналогов азотистых оснований (5-бромурацил, 5-фторурацил, 5-йодурацил, 2-аминопурин, 2,6-ди-аминопурин) заключается в том, что они индуцируют мутации только при воздействии на реплицирующиеся молекулы ДНК и РНК. Наиболее хорошо изучены 5-бромурацил и 2- аминопурин. Тимин является урацилом, у которого атом водорода (Н) в одной из СН-групп заменен метальной группой (СН 3) - метилурацил. Однако в урациле этот атом водорода можно заменить и другим атомом, например атомом брома (Br). В результате такой замены получается новое соединение - бромурацил, который является аналогом тимина. Структура основного кольца у обоих соединений совершенно одинакова, а различие заключается лишь в одной группе (Br вместо СН 3).

Мутации, индуцируемые алкилирующими соединениями , проявляются простыми (транзиция) и сложными (транверсия) заменами в молекуле нуклеиновой кислоты. Из ДНК удаляются пурины (в основном гуанин), и в зависимости от того, какой нуклеотид встретится напротив бреши при репликации, либо возникает мутация типа замены, либо не возникает ее совсем. К данной группе веществ относятся алкилирующие соединения - иприт и его аналоги, этиленимин и его аналоги - этилметансульфонат и этилэтансульфонат и др. Этилметансульфонат и этилэтансульфонат вызывают алкилирование гуанина и в меньшей степени аденина. Это приводит к гидролизу связи между пуриновым основанием и сахаром и утрате пуринового основания. Мутагенное действие этих соединений было показано с вирусами болезни Ньюкасла и клещевого энцефалита.

Мутагенное действие гидроксиламина заключается в образовании простых замен оснований в молекуле нуклеиновой кислоты (направление зависит от типа нуклеиновой кислоты вируса). У ДНК-содержащих вирусов этот мутаген реагирует исключительно с цитозином. У РНК-содержащих вирусов он вступает в реакцию как с цитозином, так и с урацилом, что обусловливает замены цитозина на урацил и наоборот.

С помощью гидроксиламина были индуцированы мутации у вирусов герпеса, болезни Ньюкасла, полиомиелита. Спонтанные мутанты вируса обычного герпеса (по признаку чувствительности к ингибиторам агара) не способны ревертировать под действием гидроксиламина и, следовательно, обусловлены заменой ГЦ на АТ.

Синтезирован и изучен один из аналогов гидроксиламина - оксиметилгидроксиламин, реагирующий только с цитозином, но не с урацилом РНК, т. е. обладающий более высокой специфичностью и одной направленностью мутагенного действия.

К веществам, химически изменяющим основания в покоящейся молекуле нуклеиновой кислоты, относится также гидразин, который действует только на пиримидиновые основания.

Мутагенное действие интерколирующих агентов заключается в способности соединений встраиваться между витками молекулы ДНК - явление интерколяции. При внедрении акридина между основаниями ДНК изменяется расстояние между ними на 0,34-0,7 нм. Мутагенное действие акридина изучено главным образом на бактериофагах.

У вирусов человека и животных с помощью профлавина индуцированы различные типы мутаций при воздействии на внутриклеточный вирус полиомиелита, клещевого энцефалита и оспы коров. В сочетании с видимым светом красители акридинового ряда обладают выраженным летальным действием на ДНК-содержащие вирусы.

Мутагенным действием обладают нитрозосоединения (N-нитрозометилмочевина, N-нитрозоэтилмочевина, 14-метил-М-1-нитpo-N-нитрозогуанидин) и их производные. При щелочном pH мутагенный эффект нитрозосоединений обусловлен образующимся диазотметаном, а при кислом pH - азотистой кислотой.

Для вирусов человека и животных мутагеном является и формальдегид; были индуцированы мутанты у вируса полиомиелита и вируса западного энцефаломиелита лошадей при воздействии соответственно на очищенную РНК и внутриклеточный вирус. Механизм мутагенного действия формальдегида недостаточно изучен.

Мутагенное действие азотистой кислоты заключается в изменении оснований в покоящейся молекуле нуклеиновой кислоты. Наиболее хорошо изучены азотистая кислота (HNO 2) и гидроксиламин. Азотистая кислота как мутаген дезаминирует органические основания [отщепляет молекулы аминогруппы (NH 2)].

В результате действия азотистой кислоты аденин (А) превращается в гипоксантин (Гк), гуанин (Г) - в ксантин (К), а цитозин (Ц) - в урацил (У). У дезаминированных органических оснований возникают новые свойства.

Физические мутагены . Мутагенное действие повышенной температуры (40-50 °С) обнаружили Е. Фриз на опыте с бактериофагом Т4 и Ю. 3. Гендон при обработке РНК вируса полиомиелита. Температура способствует удалению пуринов (апуринизация, преимущественно гуанина) из ДНК.

При репликации такой ДНК напротив бреши, вызванной утратой пурина, в синтезирующуюся цепь могут быть включены любые нуклеотиды. Если включится основание, которого на этом месте ранее не было, то это означает появление мутации (транзиции или трансверсии).

Мутагенное действие ультрафиолетового излучения . Ультрафиолетовые лучи (УФ) взаимодействуют с молекулами нуклеиновых кислот и «поглощаются» органическими основаниями, особенно при длине волны 260-280 нм. Тимин (Т), урацил (У) и цитозин (Ц) более чувствительны к УФ, чем аденин (А) и гуанин (Г). При облучении структура указанных пиримидинов изменяется; две соседние молекулы тиминов соединяются друг с другом в пары, образуя так называемые тиминовые димеры.

Впервые мутагенное действие УФ-лучей на бактериофаги установили американский ученый Кригер (1958), затем Эльмер и Каплан (1959).

Примеры: мутацию у внеклеточного фага Сд получил А. С. Кривинский, используя метод УФ-воздействия на внутриклеточный вирус, удалось получить мутанты вируса болезни Ньюкасла, отличающиеся от исходного штамма по репродукции в культуре клеток.

Под влиянием УФ-лучей получен мелкобляшечный мутант вируса западного лошадиного энцефаломиелита (WEE), обладающий стабильным S-фенотипом в культуре клеток ФКЭ. Установлена возможность получения мутаций при воздействии УФ-лучей на репродуцирующийся вирус и его нуклеиновую кислоту, в которой происходят структурные нарушения РНК: урацил образует лимеры и гидраты.

Факторов, влияющих на эффективность и направленность мутагенеза, по крайней мере восемь:

1) природа мутагена;

2) специфические особенности вируса. В одинаковых экспериментальных условиях один и тот же мутаген может неодинаково индуцировать мутации у разных вирусов и даже штаммов одного и того же вируса;

3) период взаимодействия вируса с клеткой. Мутации могут возникать при воздействии мутагенами на покоящуюся и вегетативную формы вируса. Во втором случае мутагенный эффект связан не только с возможностью проникновения мутагена в клетку, но и с возможностью возникновения неразрывной связи с репликацией вирусного генома.

На разных этапах репродукции различна чувствительность генетического материала вируса к действию мутагенов, что особенно ярко проявляется у РНК-содержащих вирусов с односпиральным геномом. Например, этиленимин впервые успешно применили для индукции мутаций у вирусов позвоночных при воздействии на репродуцирующуюся популяцию вируса клещевого энцефалита.

Была установлена зависимость летального и мутагенного действий вещества от стадии репродукции вируса: наибольший мутагенный и летальный эффект наблюдали при воздействии этим мутагеном в первые 2 ч латентного периода, т. е. в начальной стадии образования репликативных форм;

4) число репликаций, происходящих у вируса после воздействия на него мутагеном;

5) избирательность взаимодействия мутагена с генами вируса. Эффективность и специфичность действия мутагенов зависят от концентрации мутагена, pH, солевого состава среды и ряда других факторов. Для многих мутагенов обнаружена прямая зависимость между интенсивностью мутагенеза и дозой. Однако с увеличением дозы и усилением мутагенного эффекта снижается и выживаемость вируса. Существует математическая зависимость между величиной, определяющей частоту мутаций, и выживаемостью последнего;

6) условия обработки (pH среды, ее состав, температура);

7) тип клеточной системы;

8) условия культивирования. Индуцированный мутагенез зависит от состава питательной среды, в которой находится система «вирус - клетка». При отсутствии в среде роста тимина происходит более интенсивное включение 5-бромурацила в нуклеиновую кислоту.

Воздействие перечисленных мутагенных факторов на нативный (исходный) вирус менее эффективно, что обусловлено:

• меньшей доступностью вирусной нуклеиновой кислоты воздействию мутагенов, неспособных проникать через белковую оболочку вируса;
• определенным стабилизирующим действием вирусного белка, имеющего тесные внутренние связи с нуклеиновой кислотой.

Стабильность мутантов . Не все мутации, образующиеся под влиянием мутагенов, одинаково стабильны. Различия в стабильности связаны с неодинаковым молекулярным механизмом действий использованных мутагенов. Мутанты, полученные при действии повышенной температуры, кислой среды, УФ-лучей и ультразвуковых волн, дают около 20 % реверсий. Это связано с тем, что они вызывают главным образом локальные изменения вирусной нуклеиновой кислоты, ведущие к замене отдельных оснований. При воздействии профлавина все мутанты оказались полностью стабильными. Причиной мутаций являются выпадения или вставки оснований. При получении вакцинных вирусных штаммов путем воздействия на вирус мутагенами целесообразно использовать мутагены, вызывающие более глубокие изменения генетического кода - типа выпадений или вставок, так как такие мутанты обладают стабильностью наследственных свойств.

Мутации, возникающие при пассажах (адаптации) вирусов . Мутантные популяции вирусов могут возникать и в результате адаптации их к биологическим системам in vitro (культуры клеток) и in vivo (животные, куриные эмбрионы).

Мутации при пассажах на животных . При адаптации вирусов к естественно восприимчивым животным или к гетерогенным тканям экспериментально-восприимчивых животных решающее значение в работе имеют многие факторы:

• свойства вируса и способ его введения. Немалое значение имеют и свойства штамма. Например, разные штаммы вируса уличного бешенства требуют различного числа пассажей для превращения их в штамм фиксированного вируса;
• вид и возраст животного. Значение имеет ослабление резистентности хозяев (воздействие кортизоном, температурой, γ-облучением и т. п.).

Существует много примеров влияния используемого при пассажах вида животного на изменение биологических свойств вируса.

Примеры , которые имели положительный исход в виде получения генетически стабильных безвредных живых вакцин:

1) путем серийных пассажей вируса бешенства (штамм Флюри) через мозг однодневных цыплят и далее в куриных эмбрионах (заражение в желточный мешок) получили вакцинный штамм (virus fixe), который апатогенен для кроликов, мышей и собак (варианты Нер и Lep);

2) многократными пассажами вируса желтой лихорадки через мозг мышей значительно усилились нейротропные свойства вируса для мышей и утратились свойства патогенности для обезьян. После 258-260 пассажей адаптированный вирус с 1939 г. применяют для иммунизации людей против этой инфекции;

3) длительные пассажи вируса чумы крупного рогатого скота через организм коз привели к ослаблению его вирулентности для восприимчивых животных. В 1948 г. был получен аттенуированный вариант вируса, применяемый для вакцинации крупного рогатого скота (штамм Эдварде);

4) аналогичным образом Накамура и Миямато адаптировали к кролику вирус чумы крупного рогатого скота (штамм L), который применяют в качестве высокоэффективной живой вакцины;

5) пассажами на мышах и морских свинках удалось преобразовать висцеротропную природу вируса чумы лошадей в нейротропную и получить безвредные для лошадей вакцинные штаммы;

6) длительные пассажи вируса ящура через организм новорожденных кроликов или мышей привели со временем к аттенуации вируса в отношении крупного рогатого скота. Типовая принадлежность при этом не менялась;

7) в результате серии пассажей вируса гриппа (наиболее изменчивый как в экспериментальных, так и в естественных условиях) на мышах (интраназальное введение), он приобрел высокую патогенность для этих животных и вместе с тем утратил патогенность для человека. У адаптированных к мышам штаммов изменился и ряд других свойств: ингибиторочувствительность, терморезистентность и др. Это свидетельствует о глубоких изменениях наследственности вируса.

Мутации при пассажах на куриных эмбрионах . Наследственная изменчивость вирусов наблюдалась и при пассажах их на куриных эмбрионах. Были получены вакцинные штаммы для профилактики инфекционного бронхита, инфекционного ларинготрахеита птиц, чумы собак, катаральной лихорадки овец (блютанга), чумы крупного рогатого скота, болезни Ньюкасла и др.

Мутации при пассажах в культурах клеток . В культурах клеток и тканей успешно выращиваются и аттенуируются многие вирусы:

• после длительных пассажей в культуре переживающей ткани куриных эмбрионов вирус желтой лихорадки утратил нейротропные и висцеротропные свойства, сохранив иммуногенность. Полученный штамм 17Д успешно используют в качестве живой вакцины;
• получили ряд аттенуированных штаммов вируса полиомиелита (трех типов) путем пассажа в культуре клеток почки обезьян. Вакцина, приготовленная из этих штаммов, безвредна для людей, вызывает напряженный и длительный иммунитет, обеспечивающий невосприимчивость к циркулирующим в природе диким штаммам вируса полиомиелита;
• методом пассажа в сочетании с селекцией в культуре клеток вируса чумы крупного рогатого скота (штамм LIII Накамура) получили аттенуированный ареактогеиный вакцинный штамм ЛТ.

Много сообщений о получении наследственно ослабленных иммуногенных штаммов вируса ящура, инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи, миксоматоза кроликов и парагриппа-3 крупного рогатого скота при адаптации к различным видам культур клеток.

Причины возникновения мутаций в процессе адаптации . Изменение свойств вируса в процессе пассажей происходит ступенчато. В первых пассажах обнаруживают главным образом вирионы, изменившие какой-либо один генетический признак. С увеличением числа пассажей в популяции выявляют вирионы, изменившие два и более генетических признака; количество таких частиц постоянно возрастает, и в дальнейшем у подавляющего большинства вирусных частиц наблюдают изменение многих генетических признаков.

В основе механизма наследственной изменчивости вирусной популяции при пассажах лежат два процесса: мутация и селекция. В том и другом процессе важную роль играет внешняя среда, которая является одновременно индуктором мутации и селективным фактором.

Если гетерогенную вирусную популяцию, которая имеет в составе измененные и исходные вирусные частицы, культивировать в обычных условиях, то происходит ее реверсия. Например, как показали исследования с аттенуированным вирусом полиомиелита типа 3, реверсия измененных признаков может быть связана не только с гетерогенностью вирусной популяции, но и с наличием в генетически однородной популяции частиц вируса, обладающих низкой стабильностью наследственных свойств.

Накопилось большое число фактов об изменчивости вируса, вызываемой хозяином (host-controlled variation). Изменения заключаются в том, что клетка влияет на характер синтезируемых в ней компонентов вируса. Такие модификации не затрагивают нуклеотидную последовательность генома вируса. Они описаны у ДНК-содержащих бактериофагов, вируса Сендай, болезни Ньюкасла, гриппа и др. Состав белков, закодированных в геноме вируса, может модифицироваться клеткой-хозяином. Это обусловлено наличием в клетке особых мутагенных форм тРНК с нарушенным соответствием между антикодоном и кодоном соответствующей аминокислоты.

Возможны модификации, вызванные включением в вирусную частицу компонентов клетки-хозяина (главным образом белков и липидов): миксовирусы, парамиксовирусы, оболочка которых представляет собой модифицированную клеточную мембрану. Такая мембрана содержит как клеточные липиды, так и клеточные белки хозяина. Поэтому при смене клетки-хозяина (клеточной системы или вида организмов) в структуре оболочки вируса меняются и клеточные антигены.

Антигенные варианты альфавирусов и флавивирусов связаны с условиями культивирования в различных системах хозяина. Белковые компоненты клеток-хозяев включаются в суперкапсидную оболочку вириона, вызывают изменения его антигенной характеристики.

Таким образом, клетка-хозяин может существенно влиять на фенотип вируса или блокировать (частично или полностью) его репродукцию.

Последствия мутаций :

• изменение фенотипических проявлений в нормальных условиях. Например, увеличивается или уменьшается размер бляшек под агаровым гелем; увеличивается или ослабляется нейровирулентность для определенного вида животных; вирус становится более чувствительным к действию химиотерапевтического агента и т. д. Морфологические или структурные мутации могут касаться размера вириона, первичной структуры вирусных белков, изменения генов, детерминирующих ранние и поздние вирусоспецифические ферменты, обеспечивающие репродукцию вируса;
• летальная мутация, при которой нарушается синтез или функция жизненно важного вирусоспецифического белка, например вирусной полимеразы;
• условно-летальная мутация, при которой вирусоспецифический белок сохраняет свои функции в определенных, оптимальных для него условиях и теряет функции в неблагоприятных условиях. Примером таких мутаций являются температурно-чувствительные (от англ. temperature-sensitive) - ts-мутации, при которых вирус теряет способность размножаться при повышенных температурах (39-42 °С), сохраняя эту способность при обычных температурах выращивания (36-37 °С).

Отбор мутантов . При работе с измененными организмами важно изучить мутационную изменчивость того или иного вируса и отобрать интересующие мутанты. Для отбора определяют физико-химические и биологические свойства мутантов:

• связь между изменением определенного признака (маркера) и вирулентностью (реактогенности, иммуногенности и других свойств вируса) - ковариация генетических признаков у мутантов;
• природу мутантного фенотипа: способность к репродукции в той или иной системе, терморезистентность, гемагглютинирующие, гемолизирующие и другие свойства.

Поскольку в вирусологии исследуют свойства популяции в целом, то для проявления изменения наследственности вируса необходим процесс селекции, т. е. создание таких условий, при которых происходит преимущественное размножение вирусных частиц с измененной наследственностью. В результате вся вирусная популяция будет состоять из однородных генетических мутантных вирионов.

При получении генетически однородной популяции в экспериментальных исследованиях используются следующие методы селекции:

• выделение клонов из одиночных пустул на хорионаллантоисной оболочке куриного эмбриона;
• селекция клонов из бляшек на культуре клеток;
• селекция методом предельных разведений;
• селекция методом избирательной адсорбции и элюции;
• селекция методом пассажей в измененных условиях культивирования.

Для генетического анализа пригодны лишь те признаки, которые легко выявляются, достаточно стабильны и контролируются единичной мутацией. У вирусов животных такие сложные признаки, как патогенность, вирулентность, антигенная структура, контролируются не одним, а многими генами.

В настоящее время отбор мутантов вирусов животных проводится на основе анализа условно-летальных мутаций. Все условнолетальные мутанты данного класса (например, все ts-мутанты) обладают одним общим признаком и фенотипически в большинстве случаев неразличимы. Одной из причин возникновения ts-чувствительности в результате мутации является изменение первичной структуры какого-либо белка, например фермента. Причем это изменение таково, что при пермиссивной температуре фермент работает, а повышение (понижение) температуры изменяет его конформацию сильнее, чем конформацию белка дикого типа, и приводит к отсутствию ферментативной активности у мутантного белка.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter .

У вирусов роль хромосом выполняет нить нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК), у одних она цельная, у других (грипп, рео- ареновирус) – фрагментированная. Отдель­ные участки нуклеиновой кислоты, ответственные (детерминирующие) за синтез определенного белка, получили название генов. Простейшие из известных вирусов содержат от трех до пяти генов (например, ДНК-содержащий вирус полиомы; у пикорнавирусов 6-8 генов). Однако у более сложного вируса (например, крупного бактериофага Т4) более 30 генов контролируют синтез белков оболочки и не менее 15 - синтез нуклеотидных предшественников; для размножения этого фага тре­буется участие примерно сотни генов.

Ген не является неделимым. У него имеются более мелкие участки (мутоны, реконы), несущие определенные функции. Как известно, ген является носителем одновременно трех свойств:

1) контролирует тот или иной признак организма (функция),

2) обменивается в скрещиваниях (рекомбинация) и

3) изменяется (мутация).

Понятие цистрон соответствует понятию ген - единице функции, т. е. соответствует инфор­мации об одном белке.

Синтез ферментов у вирусов закодирован в генах. Любой фермент (белок) может синтезироваться только в том слу­чае, если в нуклеиновой кислоте имеется соответствующий ген, кодирующий синтез данного фермента. Последовательность работы цистронов определяется индукцией или репрессией.

Под геномом вируса понимают совокупность всех генов данного вируса. У од­них вирусов геном образован одной молекулой нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК), у других - несколькими молекулами (вирусы гриппа, рео- и аренавирусы).

Фенотип - это совокупность всех внешних и внутренних признаков и функции данного вируса. Генотип же определяется только структурой наследственного материала - ДНК или РНК, т. е. последовательностью нуй-леотидов в их молекулах или кодом белкового синтеза. Фенотип вируса не является его постоянным свойством. Генотип же - это постоянное свойство вируса, и меняется он в результате мутаций, происходящих в-геноме. Мутационные измене­ния в геноме вируса влекут за собой и изменения его фенотипа.

Способы увеличения информационной емкости вирусного генома. В отличие от полицистронных иРНК прокариотов иРНК эукариотов являются моноцистронными, т.е. реализуется принцип «один ген – одна молекула иРНК – один белок». Однако у некоторых клеточных иРНК и часто у вирусных иРНК этот принцип нарушается, и иРНК может направлять синтез двух полипептидов.

Способами увеличения информации являются:

1) двукратное считывание одной и той же иРНК, но с другого иницирующено кодона;

В составе иРНК обычно встречается несколько инициирующих кодонов. В составе иРНК обычно встречается несколько инициирующих кодонов. В соответствии с принятой в настоящее время гипотезой «сканирующей модели» малая рибосомальная субъединица связывается с иРНК около 5¢-конца и скользит вниз до встречи с инициирующим кодоном. Однако инициация в большинстве случаев происходит не с первого инициирующего кодона, а с последующего АУГ - кодонов. «Правильный» функционирующий АУГ- кодон узнается рибосомой благодаря окружающим его последовательностям («фланкирующим» нуклеотидам). В том случае, если первый инициирующий кодон находится в менее благоприятном окружении, чем последующие АУГ – кодоны, большинство малых рибосомальных субъединиц пройдут этот кодон и начнут инициацию трансляции с последующих АУГ – кодонов, однако некоторые субъединицы начнут инициацию с первого АУГ – кодона. В этом случае одна иРНК может направить синтез двух белков разной длины. Такие иРНК имеются у многих вирусов.

2) сдвиг рамки трансляции;

Трансляция может происходить без сдвига рамки и со сдвигом ее. Генетический код является триплетным, это означает, что три нуклеотида, составляющих триплет или кодон, кодируют одну аминокислоту. В том случае, если триплеты сохранены и генетический код не изменился, при трансляции с двух разных инициирующих кодонов будут синтезироваться полипептиды, представляющие собой укороченный участок первого полипептида (трансляция без сдвига рамки).

В том случае, если произошел сдвиг на один или два нуклеотида, меняется смысл всех кодонов (триплетов), стоящих за местом сдвига. В этом случае одна молекула иРНК может транслироваться с образованием двух уникальных белков, т.е. таких, у которых нет идентичных аминокислотных последовательностей.

Таким образом, общее число триплетов в составе молекулы нуклеиновой кислоты может быть меньше суммы числа триплетов, входящих в состав всех генов. Более точные представления о числе генов можно получить путем биохимического и генетического анализов.

4) сплайсинг;

5) сплайсинг со сдвигом рамки широко распространен у ряда вирусов. В результате сплайсинга и сдвига рамки иРНК генов транслируются с образованием двух белков

Одним из способов экономии генетического материала является нарезание полипептида - предшественника на участки разной длины, в результате чего образуются разные полипептиды с перекрывающимся аминокислотными последовательностями.

4)транскрипция с перекрывающихся областей ДНК и и др.

В результате перекрывания генов и сдвига рамки трансляции «размыкаются» границы генов, и понятие «ген» в известном смысле утрачивает первоначальное значение как дискретный фрагмент генома и приобретает скорее функциональное значение.

Наследственность у вирусов

Наследственность - это свойство организмов обеспечивать материальную и функциональную преемственность между поколениями, а также обусловливать спе­цифический характер индивидуального развития. Изменчивость - свойство, про­тивоположное наследственности. Изменчивость вирусов может быть обусловлена мутацией генов.

Мутации у вирусов

В основе наследственного изме­нения свойств вирусов могут лежать два процесса:

1) мутация, т. е. изменение последовательности нуклеотидов в определенном участке генома вируса, ведущее к фенотипически выраженному изменению свойства, и

2) рекомбинация, т. е. обмен генетическим материалом меж­ду двумя близкими, но отличающимися по наследственным свойствам вирусами.

Мутация - изменчивость, связанная с изменением самих генов. Она может иметь прерывистый, скачкообразный характер и приводит к стойким изменениям наследственных свойств вирусов.

Все мутации вирусов делятся на две группы:

Спонтанные и

Индуцированные;

По протяженности их делят на:

Точечные и

Аберрационные (изменения, затрагивающие значительный участок генома).

Точечные мутации обусловлены заменой одного нуклеотида (для РНК-содержащих виру­сов) или одной пары комплементарных нуклеотидов (для ДНК-содержащих вирусов). Такие мутации могут иногда ревертировать с восстановлением исходной структуры генома.

Однако мутационные изменения способны захватывать и более крупные участки молекул нуклеиновых кислот, т. е. несколько нуклео­тидов. В этом случае тоже могут происходить выпадения, вставки и перемещения (транслокации) целых участков и даже повороты участ­ков на 180° (так называемые инверсии). Это будут уже более крупные перестройки в структуре нуклеиновых кислот, а следовательно, и нарушения генетической информации.

Следует отметить, что не всегда точечные мутации реализуются. Имеется ряд причин, в силу которых такие мутации могут не проявляться. Одна из них - вырожденность генетического кода. Как уже указывалось, код белкового синтеза вырожден, т, е. некоторые аминокислоты могут кодироваться несколь­кими триплетами (кодонами). Например, аминокислота лейцин может кодироваться шестью триплетами. Вот почему если в молекуле РНК вследствие каких-то воздействий произошла замена триплета ЦУУ на ЦУЦ, ЦУА на ЦУГ, то в молекуле синтезируемого белка все равно включится аминокислота лейцин. Поэтому ни структура белка, ни его биологические свойства не нарушатся.

Другое дело, когда какая-то аминокислота кодируется всего одни триплетом, например, синтез триптофана кодируется только одним триплетом УГГ и замены, т. е. синонима, не имеет. В этом случае в белок включается какая-нибудь иная аминокислота, что может привести к появлению мутантного признака.

Как спонтанные, так и индуцированные мутации делят также на прямые и обратные (реверсии). Прямые мутации меняют фенотип, а обратные его восстанавливают.

Спонтанные мутации

Спонтанные мутации у виру­сов возникают в популяции без искусственного вмешательства со стороны экспериментатора. Не может быть абсолютно однородных популяций. Однородность относительна, поэтому в вирусной популя­ции в процессе ее развития спонтанные мутанты возникают с опреде­ленной вероятностью.

Частота мутаций одного и того же признака может быть различной в зависимости от штамма. Так, частота мутаций по признаку rсt 40° у штамма W-Fox вируса полиомиелита составляла 2,4´10 -5 , тогда как у штамма.Ch-AT она была на порядок ниже - 2,0´10 -6 .

Каковы причины и механизмы возникновения спонтанных мутаций? По мнению Уотсона и Крика, спонтанные мутации могут возни­кать вследствие таутомерного (таутомерия – один из видов изомерии, при которой изомеры легко переходят друг в друга) превращения оснований, входящих в состав ДНК. Так, например, таутомерный сдвиг в положении атома водорода у аденина приводит к тому, что аденин при репликации спари­вается не с тимином, а с гуанином. Такая ошибка при спаривании осно­ваний приводит при последующих репликациях к замене пары AT и ГЦ.

Спонтанные мутации, возникшие в одном и том же гене, распре­деляются по его длине неравномерно. Одни участки гена мутируют часто, их называют «горячими» точками, другие же - редко. Кроме того, спонтанные мутации при репликации могут быть обусловлены ошибками в работе ферментов -ДНК- или РНК-полимераз.

Изучение мутационной изменчивости того или иного вируса состоит в определении физико-химических и биологических свойств мутанта. (вирулентностью, реактогенностью, иммуногенностью, способность репродукции в той или иной системе, термо-резистентность, гемагглютинирующие, гемолизирующие и другие свойства).

Мутации у вирусов могут возникать и в результате адаптации их к необычным биологическим системам in vitro (культуры клеток) и in vivo (животные, куриные эмбрионы).

Мутации при пассажах на животных. Стабильные высокоиммуногенные штаммы вирусов получают методом длительной адаптации к лабораторным, естественно-восприимчивым или невосприимчивым животным. Так, был по­лучен вакцинный штамм (virus fixe) бешенства.

При адаптации вирусов к естественно-невосприимчивым видам животных или к гетерогенным тканям экспериментально-восприимчивых животных решающее зна­чение имеют вид и возраст животного, способ введения вируса и его свойства, а также свойства штамма.

Для успеха адаптации вирусов к организму лабораторных животных сущест­венное значение имеет ослабление резистентное их путем воздействия кортизоном, температурой, облучением g-лучами и т. п.

Мутации при пассажах в культурах клеток. В культурах клеток и тканей успешно выращиваются и аттенуируются многие вирусы.

Причины возникновения мутаций в процессе адаптации. Изменение свойств вируса в процессе пассажей происходит ступенчато. В первых пассажах обнаруживают главным образом вирионы, изменившие ка­кой-либо один генетический признак; с увеличением пассажей в попу­ляции выявляют вирионы, изменившие два и более генетических признака; по мере пассирования количество таких частиц постоянно возрастает, и в дальнейшем у подавляющего большинства вирусных частиц наблюдают изменение многих генетических признаков.

В основе механизма наследственной изменчивости вирусной популяции при пассажах лежат два процесса: мутация и селекция, причем и в том, и в другом процессе важную роль играет внешняя среда, являющаяся одновременно индуктором мутации и се­лективным фактором.

Если гетерогенную вирусную популяцию, имеющую в своем составе измененные и исходные вирусные частицы, культивировать в обычных условиях, то это приводит к ее реверсии.

Наконец, накопилось большое число фактов об изменчивости вируса, вызываемой хозяином (host-controlled variation). Эти измене­ния заключаются в том, что клетка влияет на характер синтезирующих в ней компонентов вируса. Такие модификации не затрагивают нуклеотидную последовательность вирусного генома.

Таким образом, клетка хозяина может существенно влиять на фенотип вируса или блокировать (частично или полностью) его репро­дукцию.

Индуцированные мутации

Возникают при действии на вирус (на его вегетатив­ную или покоящуюся форму) различными химическими и физическими мутагенами, а также в процессе адаптации его к необычным биологическим системам (при адап­тационной изменчивости).

Применение искусственных мутагенов имеет два преимущества. Во-первых, они вызывают мутации в десятки и сотни раз эффективнее, чем природные факторы, и, во-вторых, действие некоторых искусственных мутагенов имеет известную напра­вленность, что позволяет заранее предвидеть, на какие элементы структуры нуклеи­новых кислот и каким образом действует тот или иной мутаген и какие изменения в них вызовет.

Химические мутагены. Предложено разделить мутагены на две основные группы:

1) мутагены, реагирующие с нуклеиновой кислотой только во время ее репликации (аналоги пуриновых и пиримидиновых оснований);

2) мутагены вступающие в реакцию с покоящейся молекулой нуклеиновой кислоты, но требующие для формирования мутаций последующих ее репликаций (азотистая кислота, гидроксиламин, алкилирующие соединения).

В последние годы синтезирован и изучен целый ряд химических соединений - супермутагенов (нитрозопроизводных мочевины - нитрозогуанидин и его производ­ные)

Молекулярные механизмы мутагенного действия химических соединений. В основе молекулярных изменений вирусной нуклеиновой кислоты, приводящих к мутации, лежат два основных процесса за­мена основания и выпадение или вставка основания. Различает два типа за­мены оснований, входящих в состав вирусной нуклеиновой кислоты: простую (транзиция) и сложную (трансверсия). При простой замене на место одного пуринового основания встает другое (например, вместо аденина - гуанин) или вместо одного пиримидинового основания - другое пиримидиновое основание (вместо цитозина - урацил).

При сложной замене - трансверсии вместо пуринового основания появляется пиримидиновое или пиримидиновое основание заменяется пуриновым.

Другой процесс - выпадение (делеция) или вставка оснований- ведет к более глубоким изменениям генетического кода, чем простая - замена оснований. Мутационные повреждения в одном участке генома нередко приводят к изме­нению нескольких генетических признаков, имеющих различное фенотипическое проявление (плейотропия).

Мутагенное действие аналогов азотистых оснований (5-бромурацила, 5-фторурацила, 5-йодурацила, 2-аминопурина, 2,6-диаминопурина). Аналоги основании индуцируют мутации только при воздействии на реплицирующиеся молекулы ДНК и РНК. Из этой группы соединений наиболее хорошо изучены 5-бромурацил и 2-аминопурин. Tимин (Т) является урацилом (У), в котором атом водорода (Н) в одной из СН - групп заменен метильной группой (СН 3). Другими словами, тимин - это метилурацил. Однако в урациле этот атом водорода можно заменить и другим атомом, например брома (Вr). В результате такой замены получается новое соединение - бромурацил (БУ), который является аналогом тимина, так как структура основного ядра (кольца) у обоих соединений совершенно одинакова, а различие заключается лишь в одной группе (Вr вместо СН 3).

Мутации, индицируемые алкирующими соединениями. К веществам, под дей­ствием которых основания удаляются из нуклеиновой кислоты, относятся алкирующие соединения - иприт и его аналоги, этиленимин и его аналоги - этилметансульфонат и этилэтансульфонат и др. Они непосредственно взаимодействуют с нуклеи­новыми кислотами, пуринами и главным образом с гуанином, вызывая простые (транзиции) и сложные (трансверсии) замены; из ДНК удаляются пурины (в основ­ном гуанин) и, в зависимости от того, какой нуклеотид встретится напротив бреши при репликации, либо возникает мутация типа замены, либо не возникает ее совсем.

Кроме простых замен (пурин на пурин), алкилирующие агенты способны инду­цировать сложные замены - пурин на пиримидин.

Мутагенное действие гидроксиламина. Гидроксиламин индуцирует мутации по типу образования простых замен оснований в нуклеиновой кислоте, направление которых зависит от типа нуклеиновой кислоты, которую содержит вирус. У ДНК-содержащих вирусов этот мутаген реагирует исключительно с цитозином. При воз­действии на РНК-содержащие вирусы он вступает в реакцию как с цитозином, так и с урацилом, что обусловливает замены цитозина на урацил и наоборот.

Мутагенное действие азотистой кислоты. Среди веществ, химически изменяю­щих основания в покоящейся молекуле нуклеиновой кислоты, наиболее хорошо изучены азотистая кислота и гидроксиламин. Механизм действия азотистой кислоты (HNO 2) как мутагена на нуклеиновые кислоты вирусов заключается в дезаминировании органических оснований, т. е. отщеплении от их молекул аминогруппы (NH 2). В результате действия азотистой кислоты аденин (А) превращается в гипоксантин (Гк), гуанин (Г) - в ксантин (К), а цитозин (Ц) - в урацил (У). Вследствие этой реакции у дезаминированных органических основа­нии возникают новые свойства.

Мутагенное действие повышенной температуры. Влияние повышенной температуры (40-50 °С) обнаружил Фриз в опытах с фагом Т4 и Ю. 3. Гендон при обработке РНК вируса полиомиелита. Температура способ­ствует удалению пуринов (преимущественно гуанина) из ДНК. При репликации такой ДНК напротив бреши, вызванной утратой пурина могут быть включены в реплицирующую нить любые нуклеотиды. Если включится новый тип основания, которого ранее в этом участке не было, может произойти мутация (транзиция или трансверсия).

Мутагенное действие ультрафиолетовых лучей. Действие ультрафиолетовых лучей (УФ) как мутагенов состоит в том, что они взаи­модействуют с молекулами нуклеиновых кислот и поглощаются ими, особенно лучи с длиной волны 260-280 им. Попадая в молекулу нуклеиновой кислоты, они погло­щаются входящими в ее состав органическими основаниями. Оказалось, что тимин (Т), урацил (У) и цитозин-(Ц) более чувствительны к ультрафиолетовым лучам, чем аденин (А) и гуанин (Г). В результате облучения структура указанных пиримидинов изменяется. При облучении УФ-лучами две соседние, молекулы тиминов соединяются друг с другом в пары, образуя так называемые димеры.

Репарации

Установлено, что в клетках организмов имеются своего рода корректоры, ими являются так называемые репарирующие ферменты, задача кото­рых состоит в выправлении ошибок в генетической информации, исправлении от­дельных повреждении в структуре нуклеиновых кислот. Репарирующие ферменты для исправления ошибок и повреждений в структуре нуклеиновых кислот исполь­зуют очень тонкие приемы «восстановительной микрохирургии». Они распознают каким-то образом в молекулах нуклеиновых кислот аномальные кодоны и повре­ждённые участки и стараются их по возможности быстро исправить. Любую ошибку в генетической информации репарирующие ферменты стремятся исправить до начала репликации нуклеиновых кислот, так как в противном случае эта ошибка при мат­ричном механизме копирования перейдет к дочерним молекулам нуклеиновых ки­слот, передастся потомству и станет наследственной.

Один из ферментов, участвующих и восстановлении первичной структуры ДНК (эндонуклеаза), «отрезает» поврежденный нуклеотид от соседнего нуклеотида слева, а другой фермент - справа. Вырезанный аномальный нуклеотид (или участок мо­лекулы) отбрасывается в окружающую среду. Затем приступает к работе другой фермент (экзонуклеаза), который расширяет брешь, образовавшуюся в нити ДНК. Далее фермент ДНК-полимераза восстанавливает недостающие участки поврежде­ний нити согласно закону комплементарности, т. е. в соответствии со второй нитью. На последнем этапе вновь синтезированные участки «сшиваются» в прочную единую цепь с помощью фермента лигазы, благодаря чему восстанавливается исходная мо­лекула ДНК, не имеющая структурных изъянов.

Подобно тому, как естественный отбор формировал эволюцию человека, животных, растений и всех живых организмов на нашей планете, этот же процесс происходит в огромном, невидимом человеческому глазу, мире вирусов. Хотя вирусы не могут «технически» жить самостоятельно, – для своих репродуктивных функций им необходим организм-хозяин,– они постоянно подвержены эволюционным влияниям.

Вирусы представляют собой неклеточную форму жизни без собственной системы образования энергии, поражающие живые организмы, необходимые им для размножения. Только внутри животной или растительной клетки, вирус способен изменяться и формировать новые вирусные структуры. Для человека, животных и растений вирусы – это источник многих заболеваний.

Иммунная система человека использует ряд приемов для борьбы с патогеном (микроорганизм, вызывающий болезнь). А патоген, в свою очередь, находит ответные приемы, чтобы избежать губительного влияния иммунной системы. Это происходит путем создания многочисленных копий, которые распространяются по клеткам пораженного организма. Новообразованное поколение вируса наследует именно те характеристики, которые являются сильной стороной этого вида и помогают выжить, а те свойства, которые затрудняют распространение, просто теряются. Такая несложная система представляет невиданную силу и таит в себе угрозу образования заболеваний, с которыми медицина не успевает справляться.

Возьмем, например, вирус, который мутировал и стал смертельным для своего хозяина. В течение считанных часов человек погибает от инфекции. А вирусу требуется новый, здоровый организм для своего потомства. В том случае, если «хозяин» погиб раньше, чем кто-либо от него заразился, мутация исчезнет.

Единственным способом, которым организм-хозяин защищает себя от вируса, является выработка антител. Антитела защищают клетки хозяина от проникновения вируса, образуя снаружи клетки мощный щит, не пропускающий белок конкретного вирусного штамма. Мутировавший вирус, который оказывается отличным от других, поразивших хозяина, получает преимущество: у хозяина отсутствует сформированный ранее иммунитет в виде антител к этому вирусу.

Несмотря на отсутствие клеточной структуры, природа вирусов зашифрована в их генах (которых может быть всего два или многим более, до 200). Различают ДНК и РНК вирусы. ДНК является более стабильной молекулой, чем РНК, а также ДНК вирусы обладают особым свойством проверки своей структуры, что является частью их репродуктивной функции. Для этого они используют клетку хозяина, которая контролирует репликацию правильного набора ДНК. Таким образом, ДНК вирусы практически не подвержены изменению, а, следовательно, их мутация близка к нулю. РНК менее стабильная молекула, и функция контроля репликации у РНК вирусов отсутствует. В процессе формирования новых вирусов, при копировании РНК, очень часто возникают ошибки. Вирусы мутируют и представляют особую опасность для человека. Самыми распространенными РНК вирусами являются вирусы гриппа и иммунодефицита человека (вызывающего СПИД).

Вакцинация – это искусственно созданный способ предотвращения заболевания, вызываемого вирусами, которые уже были основательно изучены учеными-медиками. Вакцина (которую в большинстве случаев в кровь вводят еще в детстве) содержит уже готовые антитела и организм оказывается защищенным от таких серьезных заболеваний, как полиомиелит, корь, паротит и других. Вирусологи всего мира не прекращают работы по изучению природы новых вирусов и созданию современных вакцин для защиты человечества.

Самым частым вирусным заболеванием, которым ежегодно страдают миллионы людей, является грипп. Его вирус особенно подвержен мутациям, что на сей день делает невозможным создание универсальной вакцины, которая бы раз и навсегда защитила человека от этого заболевания. Каждый сезон ученые создают новую вакцину, направленную против конкретного штамма вируса гриппа, претерпевшего очередную мутацию. Последние годы сезонная вакцинация против гриппа становится все более и более массовой, но нет полноценной гарантии, что в индивидуальном случае она окажется эффективной. Современные научные технологии и передовые умы из области медицины, своевременно реагируют на появление новых мутация и вирусов, которые несут особую опасность для человека. Самым последним тревожным сообщением в мире вирусологии является вспышка вируса Эболы, проявившаяся на африканском континенте летом 2014 года. Пока, ученые выяснили только то, что вирус отличается высокой степенью мутации – от человека к человеку вирус попадает уже в мутировавшей форме. Прогнозы ученых пока неутешительны, поскольку есть предположения, что пандемия вирусной геморрагической лихорадки (возбудитель – вирус Эбола) охватит более 20 тыс. человек в период от шести до девяти месяцев. Но исследования и попытки создания эффективной вакцины и лекарств для лечения этого вируса, не прекращаются, и остается только надеяться, что они увенчаются успехом, и человечество будет спасено от смертельной угрозы.

Введение

Повышение сохранности и продуктивности сельскохозяйственных животных невозможно без дальнейшего совершенствования ветеринарного обслуживания животноводства. Среди ветеринарных дисциплин важное место принадлежит вирусологии. Современный ветеринарный врач должен знать не только клинико - патологическую сторону болезни, но и иметь четкое представление о вирусах, их свойствах, методах лабораторной диагностики и особенностях постинфекционного и поствакцинального иммунитета.

Вирусы изменяют свой свойства как в естественных условиях размножения, так и в эксперименте. В основе наследственного изменение свойств вирусов могут лежать два процесса: 1) мутация, т. е. изменение последовательности нуклеотидов в определенном участке генома вируса, ведущее к фенотипически выраженному изменению свойства; 2) рекомбинация, т. е. обмен генетическим материалом между двумя близкими, но отличающимися по наследственным свойствам вирусами.

Мутация у вирусов

Мутация - изменчивость, связанная с изменением самих генов. Она может иметь прерывистый, скачкообразный характер и приводить к стойким изменением наследственных свойств вирусов. Все мутации вирусов делятся на две группы:

· спонтанные;

· индуцированные;

По протяженности их делят на точечные и аберрационные (изменения, затрагивающие значительный участок генома). Точечные мутации обусловлены заменой одного нуклеотида (для РНК-содержащих вирусов). Такие мутации могут иногда ревертировать с восстановлением исходной структуры генома.

Однако мутационные изменения способны захватывать и более крупные участки молекул нуклеиновых кислот, т. е. несколько нуклеотидов. В этом случае тоже могут происходить выпадения, вставки и перемещения (транслокация) целых участков и даже повороты участков на 180° (так называемые инверсии), смещения рамки считывания - более крупные перестройки в структуре нуклеиновых кислот, а следовательно, и нарушения генетической информации.

Но не всегда точечные мутации приводят к изменению фенотипа. Имеется ряд причин, в силу которых такие мутации могут не проявляться. Одна из них - вырожденность генетического кода. Код белкового синтеза вырожден, т. е. некоторые аминокислоты могут кодироваться несколькими триплетами (кодонами). Например, аминокислота лейцин может кодироваться шестью триплетами. Вот почему, если в молекуле РНК вследствие каких-то воздействий произошла замена триплета ЦУУ на ЦУЦ, ЦУА на ЦУГ, то в молекуле синтезируемого белка все равно включится аминокислота лейцин. Поэтому ни структура белка, ни его биологические свойства не нарушатся.

Природа пользуется своеобразным языком синонимов и, заменяя один кодон другим, вкладывает в них одно и тоже понятие (аминокислоту), сохраняя, таким образом, в синтезируемом белке его естественную структуру и функцию.

Другое дело, когда какая-то аминокислота кодируется всего одним триплетом, например, синтез триптофана кодируется только одним триплетом УГГ и замены, т. е. синонима, не имеется. В этом случае в белок включается какая-нибудь иная аминокислота, что может привести к появлению мутантного признака.

Аберрация у фагов обусловлена делециями (выпадением) различного числа нуклеотидов, от одной пары до последовательности, которая обуславливает одну или несколько функций вируса. Как спонтанные, так и индуцированные мутации делят также на прямые и обратные.

Мутации могут иметь разные последствия. В одних случаях они ведут к изменению фенотипических проявлений в нормальных условиях. Например, увеличивается или уменьшается размер бляшек под агаровым покрытием; увеличивается или ослабляется нейровирулентность для определенного вида животных; вирус становится более чувствительным к действию химиотерапевтического агента и т. п.

В других случаев мутация является летальной, так как вследствие ее нарушается синтез или функция жизненно важного вирусспецифического белка, например вирусной полимеразы.

В некоторых случаях мутации являются условно летальными, так как вирусспецифический белок сохраняет свои функции в определенных для него условиях и теряет эту способность в неразрешающих (непермиссивных) условиях. Типичным примером таких мутаций являются температурно-чувствительные - ts-мутации, при которых вирус теряет способность размножаться при повышенных температурах (39 - 42°С), сохраняя эту способность при обычных температурах выращивания (36 - 37°С).

Морфологические или структурные мутации могут касаться размера вириона, первичной структуры вирусных белков, изменения генов, детерминирующих ранние и поздние вирусспецифические ферменты, обеспечивающие репродукцию вируса.

По своему механизму мутации могут быть тоже разными. В одних случаях происходит делеция, т. е. выпадение одного или нескольких нуклеотидов, в других - происходит встраивание одного или нескольких нуклеотидов, а в некоторых случаях - замена одного нуклеотида другим.

Мутации могут быть прямыми и обратными. Прямые мутации меняют фенотип, а обратные (реверсии) - его восстанавливают. Возможны истинные реверсии, когда обратная мутация происходит вместе первичного повреждения, и псевдореверсии, если мутация происходит в другом участке дефектного гена (интрагенная супрессия мутации) или в другом гене (экстрагенная супрессия мутации). Реверсия не является редким событием, так как ревертанты обычно более приспособлены к данной клеточной системе. Поэтому при получении мутантов с заданными свойствами, например вакцинных штаммов, приходится считаться с возможной их реверсией к дикому типу.

Вирусы отличаются от остальных представителей живого мира не только своими малыми размерами, избирательной способностью размножаться в живых клетках, особенностями строения наследственного вещества, но и значительной изменчивостью. Изменения могут касаться величины, формы, патогенности, антигенной структуры, тканевого тропизма, устойчивости к физико - химическим воздействиям и других свойств вирусов. Значение причин, механизмов и характера изменения имеет большое значение при получении необходимых вакцинных штаммов вирусов, а также для разработки эффективных мер борьбы с вирусными эпизоотиями, в процессе которых, как известно, свойства вирусов могут существенно изменят одной из причин сравнительно высокой способности вирусов изменять свои свойства является то, что наследственное вещество этих микроорганизмов менее защищено от воздействия внешней среды.

Мутация вирусов может возникать в результате химических изменений цистронов или нарушения последовательности их расположения в структуре молекулы вирусной нуклеиновой кислоты.

В зависимости от условий различают естественную изменчивость вирусов, наблюдаемую в обычных условиях размножения, и искусственную, получаемую в процессе многочисленных специальных пассажей или путем воздействия на вирусы особых физических или химических факторов (мутагенов).

В естественных условиях изменчивость проявляется не у всех вирусов одинаково. Наиболее ярко этот признак выражен у вируса гриппа. Значительной изменчивости подвержен вирус ящера. Об этом свидетельствует наличие большого количества вариантов у разных типов этих вирусов, и существенные изменения его антигенных свойств в конце почти каждой эпизоотии.